O silenciamento epigenético pelo complexo SMC5/6 medeia o HIV

Sep 15, 2023

Nature Microbiology volume 7, páginas 2101–2113 (2022) Cite este artigo

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Após a entrada viral e a transcrição reversa, os provírus HIV-1 que não conseguem se integrar são epigeneticamente silenciados, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Usando uma tela de nocaute CRISPR/Cas9 em todo o genoma, identificamos o complexo SMC5/6 do hospedeiro como essencial para esse silenciamento epigenético. Mostramos que SMC5/6 se liga e então SUMOila o DNA do HIV-1 cromatinizado não integrado. A inibição da SUMOilação, seja por mutagênese pontual do componente SMC5/6 NSMCE2 - uma SUMO E3 ligase - ou usando o inibidor de SUMOilação TAK-981, evita o silenciamento epigenético, permite a transcrição do DNA do HIV-1 não integrado e resgata a replicação de integrase deficiente HIV-1. Finalmente, mostramos que bloquear a expressão do complexo SMC5/6, ou inibir sua atividade de SUMOilação, suprime o estabelecimento de infecções latentes por HIV-1 em ambas as linhagens de células T CD4+ e células T humanas primárias. Coletivamente, nossos dados mostram que o complexo SMC5/6 desempenha um papel direto na mediação do estabelecimento da latência do HIV-1 ao silenciar epigeneticamente os provírus HIV-1 competentes para integração antes da integração.

A integração do DNA proviral no genoma da célula hospedeira é uma característica definidora do ciclo de vida retroviral que é essencial para a transcrição e replicação proviral1,2. Os inibidores da integrase (IN) inibem potentemente a replicação do HIV-13. Na ausência de IN funcional, os provírus HIV-1 não integrados acumulam marcas epigenéticas repressivas, incluindo trimetilação de lisina 9 na histona H3 (H3K9me3), e são depletados de marcas ativadoras, como acetilação de H3 (H3Ac)4,5. Embora o silenciamento epigenético da transcrição do DNA do HIV-1 não integrado provavelmente represente uma defesa do hospedeiro contra o DNA estranho, os mecanismos subjacentes e os fatores celulares que medeiam esse efeito permanecem incompletos6,7.

No vírus da leucemia murina (MLV), uma triagem genômica identificou componentes do complexo de hub de silenciamento humano (HUSH), bem como a proteína de ligação ao DNA NP220, como críticos para o silenciamento de DNA de MLV não integrado8. No entanto, trabalhos subsequentes9,10 falharam em detectar qualquer função do complexo HUSH ou NP220 no silenciamento do HIV-1 não integrado. Mais recentemente, uma triagem de 1.217 genes humanos considerados infrarregulados pela proteína Vpr do HIV-1 identificou um componente da manutenção estrutural do complexo cromossômico (SMC) 5/6, fator de localização do complexo SMC5/6 2 (SLF2), como crítico para silenciamento de DNA de HIV-1 não integrado. Esta triagem também mostrou que seis outros componentes do complexo SMC5/6, incluindo SMC5 e 6, bem como as quatro proteínas associadas a SMC5/6, manutenção não estrutural dos cromossomos elemento 1 a 4 (NSMCE1–4), mas não o SMC5/ 6 associado ao fator SLF1, também foram críticos para o silenciamento epigenético do DNA do HIV-1 não integrado9. Digno de nota, o complexo SMC5/6 foi previamente demonstrado ser degradado pela proteína não estrutural HBX do vírus da hepatite B (HBV) e, na ausência de HBX, o DNA epissomal do HBV também é epigeneticamente silenciado11,12. Assim, o complexo SMC5/6 não apenas participa da replicação cromossômica, recombinação e reparo13, mas também pode silenciar o DNA viral invasivo. Aqui procuramos determinar se o complexo SMC5/6 medeia o estabelecimento de infecções latentes por HIV-1.

Para identificar os fatores que silenciam transcricionalmente o DNA do HIV-1 não integrado, realizamos uma triagem de knockout CRISPR/Cas9 em todo o genoma14 na linhagem de células T CD4+ humanas CEM-SS. Transduzimos um subclone CEM-SS que expressa Streptococcus pyogenes Cas9 com uma biblioteca lentiviral expressando ~80.000 RNAs guia únicos (sgRNAs) direcionados a 19.114 genes humanos15. Sete dias depois, infectamos essas células com IN− NL-GFPΔEnv10, um derivado do HIV-1 que abriga uma deleção em env, a mutação inativadora D64V16 em IN e a estrutura de leitura aberta da proteína verde fluorescente (GFP) no lugar de nef. Este vírus retém cópias intactas dos outros seis genes do HIV-1, incluindo vpr. Às 48 h após a infecção (hpi), as células GFP+ foram coletadas por seleção de células ativadas por fluorescência (FACS), os sgRNAs recuperados por PCR (reação em cadeia da polimerase) e clonados no mesmo vetor lentiviral. Após três rodadas de seleção para células GFP+, os sgRNAs foram sequenciados e analisados ​​para enriquecimento em comparação com a biblioteca de sgRNA inicial. Conforme mostrado no gráfico do vulcão na Fig. 1a, identificamos 9 genes que foram enriquecidos > 16 vezes e tinham um valor de P <0,0005. Estes incluíram 3 receptores de superfície celular (LY9, OR52N2 e SSTR2) e 1 proteína motora (MYO1B) que não foram analisados ​​posteriormente. Esta análise também recuperou 4 dos 8 componentes conhecidos do complexo SMC5/6, nomeadamente SMC5, SMC6, SLF1 e NSMCE3, bem como a proteína de reparação de ADN SWI5 (Fig. 1a).