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Nature Communications volume 13, Número do artigo: 7962 (2022) Citar este artigo
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A atividade d,d-transpeptidase das proteínas de ligação à penicilina (PBPs) é o alvo primário bem conhecido dos antibióticos β-lactâmicos que bloqueiam a polimerização do peptidoglicano. A morte bacteriana induzida por β-lactâmicos envolve respostas a jusante complexas cujas causas e consequências são difíceis de resolver. Aqui, usamos a substituição funcional de PBPs por uma l,d-transpeptidase insensível a β-lactama para identificar genes essenciais para mitigar os efeitos da inativação de PBP por β-lactâmicos em bactérias em divisão ativa. As funções dos 179 genes condicionalmente essenciais identificados por esta abordagem vão muito além dos parceiros l,d-transpeptidase para a polimerização do peptidoglicano para incluir proteínas envolvidas na resposta ao estresse e na montagem dos polímeros da membrana externa. Os efeitos insuspeitos dos β-lactâmicos incluem a perda da ligação covalente mediada por lipoproteínas que liga a membrana externa ao peptidoglicano, desestabilização do envelope celular apesar da reticulação efetiva do peptidoglicano e aumento da permeabilidade da membrana externa. O último efeito indica que o modo de ação dos β-lactâmicos envolve penetração autopromovida através da membrana externa.
As bactérias gram-negativas, como a Escherichia coli, possuem um envelope multicamada que sustenta a pressão de turgor do citoplasma (peptidoglicano da parede celular) e atua como uma barreira química seletiva para nutrientes, resíduos e compostos tóxicos (membranas interna e externa) (Fig. 1a)1. Vários polímeros contendo proteínas, peptídeos, glicanos e porções lipídicas garantem as propriedades mecânicas e as funções de transporte do envelope. O peptidoglicano (PG), que está ligado covalentemente à membrana externa através da lipoproteína de Braun, é uma macromolécula gigante em forma de rede (ca. 109 Da) polimerizada a partir de uma unidade dissacarídeo-pentapeptídeo (Fig. 1b). As glicosiltransferases catalisam a formação de ligações glicosídicas β-1,4 entre dissacarídeos para formar cadeias de glicanos que são subsequentemente reticuladas entre si por transpeptidases (Fig. 1c). As últimas enzimas, as d,d-transpeptidases, também são chamadas de proteínas de ligação à penicilina (PBPs), pois são os alvos essenciais dos antibióticos β-lactâmicos. Para a polimerização do peptidoglicano, os PBPs interagem com a extremidade d-Ala4-d-Ala5 de uma haste pentapeptídica (daí a designação d,d) e formam uma ligação covalente entre d-Ala4 e seu resíduo Ser do sítio ativo com a liberação concomitante de d -Ala5. Na etapa seguinte, a acil-enzima resultante reage com o segundo substrato, na maioria das vezes uma haste de tetrapeptídeo, para formar um dímero Tetra-Tetra reticulado 4 → 3 com a liberação concomitante do PBP (Fig. 1c; Fig. complementar. S1a)2. Em cooperação com proteínas de andaime e endopeptidases, as d,d-transpeptidases medeiam a inserção de filamentos de glicano na macromolécula em expansão tipo rede PG, determinando assim a forma bacteriana e garantindo uma barreira mecânica contra a pressão osmótica do citoplasma durante toda a célula ciclo3,4,5,6,7.
a O envelope é composto por membranas interna (IM, cinza) e externa (OM, preta). Peptidoglicano (PG, azul) garante proteção osmótica da célula bacteriana. O IM é uma bicamada lipídica composta principalmente por fosfolipídios (PL). O MO é uma bicamada lipídica assimétrica: o folheto interno é composto por PL e o folheto externo por lipopolissacarídeos (LPS) e fosfatidilglicerídeos substituídos pelo antígeno enterobacteriano comum (ECAPGL). b Estrutura da subunidade PG (GlcNAc, N-acetil-glucosamina; MurNAc, ácido N-acetil-murâmico). c PG é uma macromolécula semelhante a uma rede feita de cadeias de glicano (polígonos azul-roxo) interligadas por hastes peptídicas curtas (círculos coloridos). Os PBPs catalisam a formação de 4 → 3 ligações cruzadas conectando a 4ª posição de uma haste doadora de acil à 3ª posição do aceptor. Dois membros da família LDT (YcbB e YnhG) catalisam a formação de 3 → 3 ligações cruzadas. Três LDTs (ErfK, YbiS e YcfS) ancoram a lipoproteína de Braun (Lpp) ao PG. Ligar o DAP na 3ª posição de uma haste doadora de PG à extremidade Arg-Lys do Lpp fornece uma ligação covalente entre o OM e o PG. A ligação PG-Lpp é hidrolisada pelo YafK LDT46,47. d Perfil de rpHPLC de muropeptídeos da cepa BW25113(ycbB, relA') cultivados sem ceftriaxona. A estrutura é inferida a partir dos fragmentos obtidos pela digestão de PG com muramidases que clivam a ligação MurNAc-GlcNAc β-1,4. e Estrutura dos muropeptídeos deduzidos de análises de espectrometria de massa. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.